At-vejledning om risikovurdering af genteknologiske forskningsprojekter mv.

2. Risikovurdering i praksis

Risikovurdering af et projekt skal følge de retningslinjer, der er beskrevet i bilag 3b i bekendtgørelsen om genteknologi og arbejdsmiljø. Eksemplerne i At-vejledningen dækker kun den foreløbige klassifikation af det biologiske system. I en endelig klassifikation skal man også inddrage andre forhold som fx det pågældende laboratoriums beliggenhed og allerede trufne foranstaltninger.

2.1. Eksempler på projekttyper

Det er ikke alle aspekter, der er lige relevante ved vurderingen af forskellige projekter. Der kan skelnes imellem følgende hovedtyper af projekter:

A. Overførsel af genetisk materiale fra mikroorganismer til andre mikroorganismer. Det væsentligste er at vurdere:

• De anvendte mikroorganismers patogenicitet.
• Hvor velkarakteriseret det overførte genetiske materiale er.
• Tilstedeværelse af konjugative plasmider eller generelt transducerende fager i vært-vektor systemet.
• Eventuelle genevoldende effekter ved gen-produkter.

Projekter, der involverer "shotgun"-kloning fra patogene til apatogene prokaryoter eller lavere eukaryoter, skal vurderes i henhold til den risikogruppe, som donororganismen er placeret i. Det skyldes, at det endnu ikke kan vides, om enkelte kloner har fået overført uønskede egenskaber. Der kan foretages nedklassificering ved senere subkloninger, eller hvis der arbejdes med velkarakteriseret materiale, der ikke koder for produkter med genevoldende effekter.

B.Overførsel af genetisk materiale fra højere eukaryoter til mikroorganismer. De væsentligste vurderinger er i høj grad analoge med A:

• Den mikrobielle værts patogenicitet.
• Hvor velkarakteriseret det overførte genetiske materiale er med hensyn til genevoldende effekter.
• Tilstedeværelse af konjugative plasmider eller generelt transducerende fager.
• Om det overførte genetiske materiale koder enten for proteiner, der kan have en effekt på humane celler udefra, eller for proteiner, der alene udøver en effekt, hvis de udtrykkes i den humane celle.

C. Overførsel af genetisk materiale fra højere eukaryoter til cellekulturer fra højere eukaryoter inkl. genterapi. Det væsentligste er at vurdere:

• Om det overførte genetiske materiale koder for produkter med biologisk eller eventuelt patogen/toksisk effekt.
• Promotorstyrke og eventuelt styrken af andre reguleringssekvenser.
• Om den anvendte vektor/virus har human specificitet.
• Om vektor/virus kan inficere eller transformere humane celler.
• Om der er hjælpervirus til stede.

2.2. Eksempler på laboratorieklasse 1-projekter

1. titel: Fremstilling af humant Adrenecorticotropisk hormon (ACTH).
Vært: Bacillus subtilis, asporogen stamme.
Donor: cDNA bibliotek fra Homo sapiens.
Vektor: pUB110 samt stærk Bacillus promotor.
Insert: ACTH-genet.

Risikovurdering
Vært:Bacillus subtilis er ikke nævnt i bekendtgørelse om biologiske agensers liste. Asporogen Bacillus subtilis �13; en reversions frekvens for sporedannelse lavere end 10-7 - vurderes at tilhøre risikogruppe 1, eftersom risikoen for allergi er nedsat på grund af den manglende sporedannelse, og organismen er apatogen og subtilisinfri.

Donor: Donormaterialet stammer fra et humant cDNA bibliotek. Donormaterialet frembyder således ikke i sig selv nogen risiko.

Vektor: Vektoren pUB110 er ikke mobiliserbar i Bacillus og bærer ikke resistens over for antibiotika, der er rettet mod patogene Bacillus-arter.

Insert: Det overførte insert koder for ACTH af human oprindelse. ACTH er et proteinhormon og et biologisk højvirksomt stof, men det har kun effekt på binyrebarken.

Sundhedsaspekter ved den endelige GMO: Den endelige GMO vil kunne producere ATCH, men vil ikke kunne overføre insertet til tarmbakterier.

Klassificering
Der vil ikke kunne forekomme skadelige virkninger som følge af naturlig transfer af ATCH til andre organismer, og projektet kan derfor udføres i laboratorieklasse 1.

2. titel: Onkogen effekt i mammale celler.
Vært: 3T3 musecellelinje.
Donor: Abelson murine leukemia virus.
Vektor: pCGBPV9.
Insert: Onkogenet abl.

Risikovurdering
Vært: Værten er en cellekultur fra en højerestående eukaryot og indeholder ikke endogene vektorer, der vil kunne mobilisere dele af det overførte genetiske materiale.

Donor: Abelson murine leukemia virus er et endogent retrovirus hos mus i naturen. Det kan inficere mus, rotter og hamstere, men ikke mennesker, og det kan ikke transformere humane celler in vitro.

Vektor: Vektoren pCGBPV9 er en sammensat vektor med replikon fra E. coli ColE1 og fra Bovin papilloma virus. Ingen del af vektoren har human specificitet.

Insert: Onkogen abl er et isoleret fragment og indeholder ikke virusstrukturproteingener, hvorfor viruspartikler ikke kan udvikles.

Sundhedsaspekter ved den endelige GMO:Onkogenet abl virker ikke eksternt på celler, da det biologiske system ikke indeholder elementer med human specificitet og derved ikke kan etableres i mennesker.

Klassificering
Onkogenprodukter er biologisk højvirksomme stoffer, og det giver anledning til at overveje, om projektet skal udføres i højere laboratorieklasse end klasse 1. Men da der ikke kan udvikles viruspartikler, kan projektet udføres i laboratorieklasse 1.

2.3. Eksempler på laboratorieklasse 2-projekter

3. titel: At rejse antistoffer mod tuberkulose-antigener.
Vært: E. coli K12.
Donor: Mycobacterium tuberculosis.
Vektor: pBR322.
Insert: Gener for M. tuberculosis antigener.

Risikovurdering
Vært: E. coli K12 er en velkendt laboratoriestamme, der erfaringsmæssigt har vist sig at være apatogen, bl.a. på grund af manglende koloniseringsevne.

Donor: Mycobacterium tuberculosis er en risikogruppe 3-organisme, jf. bekendtgørelse om biologiske agenser.

Vektor: Vektoren er non-konjugerbar og indeholder antibiotika-resistens mod Ampicillin og Tetracyclin. Disse er dog ikke transposable.

Insert: De overførte gener for M. tuberculosis antigener er ikke velkarakteriserede, da kloning er foretaget ved "shotgun"-metoden. Derfor kan der muligvis påføres værten patogene egenskaber.

Sundhedsaspekter ved den endelige GMO: Da vektoren er non-konjugerbar, vil generne ikke kunne overføres til tarmbakterier. Der er imidlertid risiko for, at nogle af coli-klonerne har fået patogene egenskaber.

Klassificering
Projektet kan ikke udføres i klasse 1, da der er usikkerhed om, hvilke risici der knytter sig til de klonede gener. Det vurderes, at de endelige GMO'er ikke vil være så patogene som donororganismen. Derfor vil projektet kunne udføres i mindst klasse 2.

Man kan overveje at nedklassificere til laboratorieklasse 1, når enkelte kloner er velkarakteriserede med hensyn til det overførte gen og dets produkts eventuelt skadelige virkning.

4. titel: Produktion af signalstoffet somatostatin ved hjælp af adenovirale vektorer.
Vært: 293 cellelinje som replikationscellelinje og en hamstercellelinje.
Donor: cDNA bibliotek fra Homo sapiens.
Vektor: Adenoviral vektor, deriveret fra Adenovirus type 5. Vektoren er deleteret i E1a og E1b regionerne i forhold til vildtype Adenovirus-genomet.
Insert: Signalstoffet somatostatin. Genet udtrykkes under kontrol af CMV- promotoren.

Vektoren med det indsatte gen indføres i 293 cellelinjen, hvorved rekombinant adenovirus dannes og amplificeres. Rekombinant adenovirus anvendes til at transducere hamsterceller in vitro.

Risikovurdering
Vært: Hamstercellelinjen er en cellekultur fra en højerestående eukaryot. 293 cellelinjen er en human cellelinje, der indeholder 14 pct. af adenovirus genomet, herunder E1 regionen.

Donor: Donormaterialet stammer fra et humant cDNA bibliotek. Donormaterialet frembyder derfor ikke i sig selv nogen risiko.

Vektor: Vektoren stammer fra adenovirus, der er en risikogruppe 2-organisme, jf. bekendtgørelse om biologiske agenser. Den forårsager influenza hos mennesker. CMV-promotoren er en middelstærk promotor.

Insert: Det klonede gen er et biologisk højvirksomt stof, der vil kunne udøve en effekt på hypofysen.

Sundhedsaspekter ved den endelige GMO: Det kan ikke udelukkes, at der kan dannes replikationskompetente virus med bred værtsspecificitet, inkl. humane celler ved rekombination i replikationscellelinjen.

Klassificering
Projektet skal udføres i mindst laboratorieklasse 2, fordi der kan dannes replikationskompetente virus med humanspecificitet, og fordi der er tale om et biologisk højvirksomt stof, der kan udøve en lokal effekt på hypofyse-celler, og som udtrykkes under kontrol af en middelstærk promotor.

2.4. Eksempler på laboratorieklasse 3-projekt

5. titel: Ekspression i eukaryote celler af gen kodende for Fibroblast Growth Factor-lignende faktor (FGF-lignende faktor).
Vært: Hamstercellelinje og Murin amfotrop pakkecellelinje.
Donor: cDNA bibliotek fra Home sapiens.
Vektor: Retroviral vektor, deriveret fra murint leukæmivirus. Vektoren indeholder mindre end to tredjedele af det retrovirale genom og er replikationsdeficient. Indeholder neomycinresistens-genet.
Insert: FGF-lignende vækstfaktor. Genet udtrykkes under kontrol af LTR�19; s (Long Terminal Repeat) enhancer/promotor.

Vektoren med det indsatte gen indføres i pakkecellelinjen, der medfører dannelse af retrovirus-partikler med bred værtsspecificitet. Det høstede virus bruges til at inficere hamsterceller in vitro.

Risikovurdering
Vært: Værterne er cellekulturer fra højerestående eukaryoter. Den murine pakkecellelinje indeholder de nødvendige gener for dannelsen af retrovirus-partikler ud fra vektoren.

Donor: Donormaterialet stammer fra et humant cDNA bibliotek. Donormaterialet udgør således ikke i sig selv nogen risiko.

Vektor: Murine retrovirus virus kan inficere mus, rotter og hamstere, men ikke mennesker, og det kan ikke transformere humane celler in vitro. Neomycin-resistensen i eukaryote celler kan selekteres med G418.

Insert: Det klonede gen koder for et biologisk højvirksomt stof, der ved en fysiologisk koncentration på få pg/ml vil kunne udøve en effekt på celler. Det klonede gen udtrykkes under kontrol af LTR's promotor, det vil sige under ikke-fysiologiske betingelser.

Sundhedsaspekter ved den endelige GMO: Det kan ikke udelukkes, at der ved rekombination i pakkecellelinjen kan dannes replikationskompetente virus med bred værtsspecificitet, inkl. humane celler.

Klassificering
Projektet skal udføres i mindst laboratorieklasse 2, fordi der kan dannes replikationskompetente virus med bred værtsspecificitet. Da det desuden er et biologisk højvirksomt stof, der udøver en ekstern effekt på celler ved en meget lav koncentration, og som udtrykkes under kontrol af en middelstærk promotor, skal projektet mindst udføres i laboratorieklasse 3.